摘要
线粒体作为卵母细胞含量最丰富的细胞器，其数量和质量直接影响卵母细胞质量与发育潜能，从而决定了女性生育的结局。线粒体自噬作为一种细胞内选择性降解功能异常线粒体的大自噬，对卵母细胞内线粒体功能维持和平衡至关重要。近年来，围绕线粒体自噬在卵母细胞内的相关功能与机制研究也逐渐成为女性生殖领域的研究热点。本文综述了线粒体自噬参与卵母细胞成熟、卵母细胞老化，以及线粒体自噬参与药物与环境刺激影响卵母细胞质量，和在辅助生殖技术中的意义，期望有利于深入理解卵母细胞线粒体自噬的生物学意义，为体外或体内改善卵母细胞质量提供帮助。
【关键词】卵母细胞;线粒体自噬;氧化应激
基金项目：贵州医科大学附属医院国家自然科学基金培育项目(gyfynsfc-2021-38)
DOI：10.3760/cma.j.cn101441-20221011-00444
近年来，女性不孕率逐年升高，同时，不孕女性的年龄也越来越大。高龄女性生育力下降大多因卵母细胞质量下降所引起[1]。高龄女性卵母细胞染色体异常风险增高，而非整倍体卵母细胞意味着低受精率和非整倍体胚胎的形成[2]。另外，高龄女性卵母细胞线粒体功能异常是引起老化卵母细胞质量低下的主要原因[3]。
线粒体是卵母细胞内含量最丰富的细胞器，为卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育提供能量支持[4]。除了为卵母细胞成熟提供能量外，有功能的线粒体还可以降低细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，减少氧化应激对卵母细胞的损伤。同时，线粒体还与卵母细胞纺锤体形成、成熟卵母细胞受精密切相关[5]。此外，有研究表明，线粒体功能异常是导致老化卵母细胞质量低下的主要因素[6]。因此，线粒体质量在卵母细胞成熟和发育潜能上具有决定性作用。利用线粒体替代疗法延长动物生育寿命的研究也充分证明了线粒体功能对卵母细胞质量的重要性[7]。
自噬是真核细胞内广泛存在的一种将待降解的细胞内成分或细胞器转运至溶酶体进行降解的生物学过程，主要有3种类型：分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬。其中，巨自噬是细胞内最广泛的一种自噬类型。线粒体自噬是一种选择性的巨自噬，负责选择性降解受损的线粒体。当线粒体自噬发生时，吞噬泡将受损线粒体包裹，形成双层膜结构的自噬体。随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，从而将线粒体水解降解，完成线粒体自噬。线粒体在进行氧化磷酸化产生能量的同时，也会产生ROS。受损的线粒体不能维持细胞内ROS平衡，导致卵母细胞氧化应激，同时还会释放大量的钙离子和细胞色素c到细胞质中，
诱发细胞凋亡。因此，卵母细胞作为所有细胞种类中线粒体含量最丰富的一种细胞，非常需要线粒体自噬来清除受损线粒体，维持卵母细胞质量。近年来，研究人员围绕卵母细胞线粒体自噬取得了一系列的研究进展，综述如下。
一、线粒体自噬参与卵母细胞成熟
线粒体自噬作为细胞内的一种选择性巨自噬，主要负责选择性降解功能紊乱的线粒体[8]。目前研究报道的线粒体自噬信号通路主要包括以下几类，LC3接头蛋白通过泛素依赖机制识别泛素化的线粒体蛋白诱导线粒体自噬;LC3接头蛋白或LC3受体通过泛素非依赖机制诱导线粒体自噬;Smurf1蛋白通过泛素非依赖机制诱导线粒体自噬;线粒体膜脂质介导的线粒体自噬;HMGB1调控线粒体自噬[9]。其中PINK1/Parkin介导的线粒体自噬途径研究较为广泛[10-11]。PINK1是一种丝/苏氨酸蛋白激酶。当线粒体受损时，PINK1不能进入线粒体内膜，而富集在线粒体外膜。随后，PINK1磷酸化修饰自身和泛素分子，招募并激活E3泛素连接酶Parkin，催化泛素分子与线粒体外膜的底物结合[12-13]。这些多聚泛素化底物被P62识别后，与LC3蛋白相互作用，进一步形成双层膜结构包裹受损的线粒体，启动线粒体自噬。
与线粒体的生物合成、融合、分裂一样，线粒体自噬对维持线粒体功能和质量也很关键。在正常情况下，线粒体自噬也时有发生，特别是在特定的生理条件下会诱导线粒体自噬激活，例如在细胞分化时，PINK1依赖的线粒体自噬会影响干细胞的多能性和分化状态;Parkin和线粒体上的E3泛素连接酶MUL1介导的线粒体自噬对小鼠受精后清除父本的线粒体DNA十分必要。这些研究都表明线粒体自噬对细胞的分化和发育具有十分重要的作用[14]。那么，线粒体自噬对卵母细胞成熟有何意义?
据报道，卵母细胞内线粒体DNA数目减少或突变增多、线粒体膜电位改变、ATP合成减少等线粒体功能紊乱都与卵母细胞质量降低密切相关[3]。2017年，Boudoures等[15]报道用羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP，降低线粒体膜电位)或抗霉素a(增加ROS)处理卵母细胞，并不能激活线粒体自噬降解功能紊乱的线粒体。同时，体内实验证实由于缺乏线粒体自噬，高脂高糖暴露所导致的小鼠线粒体功能异常可以从卵母细胞传递到囊胚期胚胎。尽管如此，Kim等[16]报道对生发泡期(GV期)卵母细胞敲低Rad51抑制卵母细胞线粒体自噬，从而发生ATP合成减少、线粒体膜电位改变和DNA降解等线粒体紊乱的现象。随后，该研究组还观察到Gas6缺失的MⅡ期卵母细胞内线粒体自噬相关基因表达下调，导致线粒体自噬发生受阻，引起线粒体的累积和聚集，并且线粒体DNA拷贝数减少，初步表明线粒体自噬可以通过维持卵母细胞内线粒体活性和数目影响卵母细胞质量[17]。因此，研究人员认为在正常的生理环境下线粒体自噬调节蛋白虽然在卵母细胞内表达，但线粒体自噬并没有激活[18]。另外，有研究报道了线粒体自噬相关基因缺失严重影响人或其他哺乳动物卵母细胞的发育潜能，从而导致不孕或生育力下降[19]。由于Keima蛋白可以在酸性和中性pH中发出不同荧光信号，因此定位于线粒体的Keima(mt-Keima)可以显示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体，从而直观反映线粒体自噬。2022年，Jin等[20]利用靶向线粒体的Keima荧光蛋白评价卵母细胞的线粒体自噬，观察到仅在生发泡期的卵母细胞能检测到大量的mt-Keima信号，进入MⅠ前期只能在核周围可以检测到mt-Keima信号，而在MⅠ期和MⅡ期的卵母细胞很难检测到mt-Keima信号。同时，线粒体相关蛋白的表达模式与mt-Keima信号一致，表明卵母细胞恢复进入减数分裂后线粒体自噬处于静默状态。研究人员用CCCP处理卵母细胞后，利用mt-Keima可以在卵母细胞内检测到线粒体自噬。因此，我们认为卵母细胞内存在线粒体自噬，且只有在GV期时会被激活，在减数分裂时期处于失活状态，而当外界环境改变或药物刺激后线粒体自噬会被激活。
二、线粒体自噬与卵母细胞老化
导致卵母细胞老化的原因较多，主要包括高龄、肥胖和吸烟饮酒等不良生活习惯[21]。已有研究表明，高龄女性来源体外成熟(in vitro maturation， IVM)培养的卵母细胞线粒体功能和线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷贝数异常，这与氧化应激增加和纺锤体形成异常具有直接的关系[22]。线粒体内缺乏保护DNA的组蛋白和有效的修复机制，并且线粒体内产生ATP的呼吸链会合成ROS，这使得线粒体DNA更容易发生突变[23]。在正常的卵母细胞内，ROS与抗氧化物质需要处于一个平衡状态，而在老化的卵母细胞内ROS显著增加，卵母细胞发生氧化应激，使得老化的卵母细胞mtDNA更容易发生突变。最近，有研究报道，随着年龄的增加，雌性恒河猴和小鼠卵母细胞内的线粒体新发突变发生频率显著增加[24-25]，这些新发突变可能导致线粒体功能紊乱，影响卵母细胞的质量，也可能传递给子代，或引起线粒体疾病。
卵母细胞老化导致mtDNA突变和拷贝数改变，线粒体功能异常，这与线粒体自噬活力高低是否相关?Jin等[20]研究表明12月龄小鼠的GV期卵母细胞线粒体自噬活性较4周龄小鼠显著降低。进一步，在秀丽隐杆线虫模型中，研究人员通过补充尿石素A促进线粒体自噬，可以减缓线虫生育力的下降[26]。综上，卵母细胞老化与线粒体自噬活力降低相关，线粒体自噬在维持老化卵母细胞线粒体功能中具有重要作用。
三、药物和环境刺激通过线粒体自噬影响卵母细胞质量
针对卵母细胞老化，线粒体功能下降的问题，研究显示添加抗氧化剂可以在体外改善线粒体功能、保护线粒体免受氧化损伤，从而减少ROS诱导的卵母细胞质量下降;而使用脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)和生长激素(growth hormone，GH)等辅助用药可以在体内直接改善卵母细胞质量[27]。机制上，DHEA是雌二醇和睾酮的前体，参与早期卵泡发育，也可以作为卵泡液睾酮的激素来源发挥作用。同时，DHEA还可以通过提高胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)的血清浓度来改善卵母细胞质量。而GH主要通过其受体和Janus激酶，促进卵母细胞成熟。另外，GH还通过释放IGF-1，增强早期卵泡发育来调节卵母细胞成熟。泛醇10和白藜芦醇是研究较多的两种用于改善卵母细胞质量的抗氧化剂。白藜芦醇具有通过激活沉寂信息调节因子1(silent information regulator of transcription 1，SIRT1)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ-辅激活因子1-α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α)，从而改善线粒体功能的作用[28]。2019年，Zhou等[29]观察到对排卵后老化的卵母细胞使用白藜芦醇进行处理可以激活线粒体自噬，使mtDNA拷贝数和ATP合成得到恢复，异常的卵母细胞纺锤体形成率显著降低，皮质颗粒分布异常的情况得到改善，卵母细胞受精后囊胚形成率显著提高，表明经白藜芦醇处理后老化卵母细胞质量得以提高。此外，在猪卵母细胞中，玉米烯酮暴露使得线粒体膜电位受损，破坏线粒体功能[30]。用线粒体自噬小体标志物TOMM20和LC3B进行免疫荧光染色，观察到添加白藜芦醇增强线粒体自噬，改善玉米烯酮暴露所导致的卵母细胞线粒体功能异常[31]。机制上，与玉米烯酮暴露组的卵母细胞相比，添加白藜芦醇可上调PINK1/Parkin信号通路蛋白的表达。同时，自噬标记蛋白LC3B-Ⅱ的表达也显著提高。以上结果表明，添加白藜芦醇通过PINK1/Parkin信号通路，增强卵母细胞线粒体自噬，从而对玉米烯酮暴露的卵母细胞起到一定的保护作用[31]。泛醇10是线粒体电子传递链上传递电子的关键中间物质，在维持线粒体活性和功能的机制方面与白藜芦醇类似[32]。在老化的卵母细胞内，线粒体合成(SIRT1和PGC-1α)和线粒体自噬(PINK1和Parkin)相关蛋白表达下调，而添加泛醇10可以提高线粒体合成与自噬相关蛋白的表达，从而增强线粒体生物合成和线粒体自噬，改善老化卵母细胞的质量[33]。
与抗氧化药物可以改善卵母细胞质量相反，一些环境物质的刺激使得卵母细胞质量下降。氮芥是一种气态烷基化剂，临床上常作为化疗药物使用。有研究表明小鼠腹腔注射氮芥会诱导线粒体自噬，导致小鼠卵母细胞质量减退和生育力下降[34]。值得注意的是，氮芥暴露的小鼠子代卵母细胞内的ROS水平升高，表明氮芥导致的线粒体损伤可能通过卵母细胞传递给子代，这与已知的子代小鼠线粒体全都来源于卵母细胞的观点相一致[34]。由于合成塑料的双酚A(bisphenol A，BPA)具有雌激素活性，目前多用替代物双酚芴[Bis(4-hydroxyphenyl)fluorene，BHPF]来合成聚酯聚合物，然而小鼠实验表明无BPA的塑料瓶所装水中可以检测到BHPF的释放，而小鼠饮用含有BHPF的水后导致小鼠子宫重量减轻，小鼠生育力显著下降[35]。最近的一项研究显示，对卵母细胞进行大剂量BHPF暴露处理可以引起卵母细胞线粒体聚集，mtDNA拷贝数下降，同时，PINK1蛋白和两个自噬体重要蛋白(Bcelin1和LC3B)表达增加，而线粒体内膜蛋白17A和外膜蛋白20表达下调，表明线粒体自噬被激活[36]。
综上，老化卵母细胞由于线粒体功能异常，导致卵母细胞质量下降。添加抗氧化剂可以激活线粒体自噬，维持线粒体功能，改善卵母细胞质量。而在正常的卵母细胞内线粒体可以正常发挥功能，维持卵母细胞的发育潜能。当在一些环境刺激物作用下线粒体功能受损，激活线粒体自噬，从而不利于卵母细胞成熟与发育。这看似矛盾的结论可能用线粒体的分裂方式进行解释。最近的研究显示，线粒体分裂方式分为外周分裂和中间分裂，在环境胁迫或者特定的生理条件下，线粒体进行外周分裂，分裂出的小的子代线粒体通过线粒体自噬进行清除，而在正常生理环境下线粒体进行中间分裂，完成线粒体增殖，满足细胞生长的能量需求[37]。
四、卵母细胞线粒体自噬与辅助生殖技术
卵母细胞IVM技术是将未成熟卵母细胞在特定培养液中体外培养至成熟卵母细胞的技术，是辅助生殖技术的重要组成部分。由于卵母细胞IVM后成熟率低、发育潜能差，IVM技术的使用受限。近年来，胚胎学家和科研人员利用卵母细胞体内成熟的特点对IVM技术进行改进，围绕IVM培养液从抗氧化剂、激素、生长因子、卵泡液、颗粒细胞等方面进行优化，同时培养方式上通过IVM前培养使得GV期卵母细胞在恢复减数分裂前充分发育，从而上调卵母细胞的IVM率和发育潜能[38]。由于卵母细胞IVM环境与体内环境存在差异，卵母细胞IVM可能导致线粒体形态发生变化以及线粒体功能相关基因的表达发生变化，影响线粒体功能。而功能紊乱的线粒体无法应对卵母细胞内ROS增加，使得卵母细胞氧化应激。这可能为使用抗氧化剂改善线粒体功能、提高卵母细胞质量提供理论支持[5]。据报道，来源于青春期小鼠的卵母细胞只在GV期能检测到线粒体自噬，而在IVM过程中并不激活线粒体自噬;而来源于高龄小鼠的GV期卵母细胞线粒体自噬受到抑制，导致功能异常线粒体积累，影响卵母细胞质量[20]。因此，使用抗氧化剂激活卵母细胞线粒体自噬是改善老化卵母细胞质量的另一个重要原因。另外，培养环境中氧气浓度也会影响卵母细胞IVM结局，高浓度的氧气可能增加卵母细胞的ROS水平，导致氧化应激[21]，不利于卵母细胞成熟。
卵母细胞的玻璃化冷冻是对女性进行生育力保存的一项重要技术。有研究表明玻璃化冷冻-复苏会使卵母细胞的ROS水平升高，导致小鼠卵母细胞线粒体损伤，影响线粒体功能[39]。在玻璃化冷冻-复苏后的猪卵母细胞中可以检测到受损的线粒体嵴和线粒体自噬小体。用氯喹抑制线粒体自噬小体的降解会进一步加剧线粒体功能的损伤，表明在猪卵母细胞玻璃化冷冻过程中，线粒体自噬参与线粒体的功能[40]。在冷冻试剂中添加脂质纳米载体共包裹的褪黑素和白藜芦醇可以降低玻璃化冷冻-复苏GV期卵母细胞内的ROS水平，避免ROS增加引起的氧化应激损伤卵母细胞，从而增强冷冻保护的作用[41]。另外，同样作为抗氧化剂的白藜芦醇提高猪卵母细胞玻璃化冷冻-复苏后的存活率主要通过增加线粒体生物合成，与玻璃化冷冻诱导的线粒体自噬无关[42]。
五、总结与展望
综上所述，线粒体自噬通过调节线粒体功能，对卵母细胞发育成熟和质量改善具有重要意义。卵母细胞老化与GV期卵母细胞不能激活线粒体自噬清除功能异常的线粒体相关，而CCCP处理或氧化应激破坏线粒体功能，导致卵母细胞成熟过程中线粒体自噬激活异常，不利于卵母细胞发育。然而，使用抗氧化剂可以通过促进线粒体自噬，提高卵母细胞质量。玻璃化冷冻导致的卵母细胞发育潜能低下可能与ROS积累、线粒体自噬激活相关。尽管如此，线粒体自噬在卵母细胞中的功能和作用机制还有不少问题尚待研究。例如，为何线粒体自噬在线粒体增长缓慢的GV期卵母细胞内激活，而在线粒体快速增长的减数分裂后期处于静默状态?除了RAB7蛋白外，还有哪些关键蛋白参与了调控?卵母细胞IVM过程中，线粒体自噬是否被激活?使用抗氧化剂改善IVM后卵母细胞质量是否与线粒体自噬相关?未来关于卵母细胞线粒体自噬的研究还需要加强卵子发生过程中线粒体自噬的调控机制，理解正常生理状态和病理状态下卵母细胞内线粒体自噬的生物学意义，从而有助于通过线粒体自噬改善临床实践中老化卵母细胞的质量，为卵母细胞质量低下相关的女性不孕症治疗提供新的思路。
来源：中华生育与避孕杂志
